TITRE    CARACTERISATION DES COMPLEXES FORMES ENTRE LE DOMAINE TRANSMEMBRANAIRE    DE LA PROTEINE OMPA ET DES POLYMERES AMPHIPHILES, LES AMPHIPOLS. APPLICATION A    L’ETUDE STRUCTURALE DES PROTEINES MEMBRANAIRES PAR RMN A HAUTE RESOLUTION.
    TITLE    CHARACTERISATION OF COMPLEXES FORMED BETWEEN THE TRANSMEMBRANE DOMAIN    OF THE PROTEIN OMPA AND AMPHIPHILIC POLYMERS, CALLED AMPHIPOLS. APPLICATION    FOR STRUCTURAL STUDIES OF MEMBRANE PROTEINS BY HIGH RESOLUTION NMR.
    AUTEUR    Manuela ZOONENS
    UNIVERSITE    Université Paris 6 – Pierre et Marie Curie
    DATE    30 Septembre 2004
    LABORATOIRE    Laboratoire de Physico-chimie Moléculaire des Membranes Biologiques – UMR 7099
    DIRECTION DE THESE    Jean-Luc Popot
    PARRAINAGE    
RESUME :
Les protéines membranaires sont habituellement maintenues solubles, en milieu aqueux, à l'aide de détergent. Or le caractère dissociant de ces derniers, combiné à la nécessité de les employer en large excès, entraîne souvent une inac-tivation de la protéine étudiée.
Depuis plusieurs années, nous développons au laboratoire de nouvelles familles de ten-sio-actifs, dont les amphipols. Ces polymères amphiphiles s’associent aux protéines membranaires par un attachement multipoint non covalent. Les complexes formés sont solubles en l’absence de détergent, et les protéines ainsi com-ple--xées sont généralement plus stables qu'en solution détergente.
Parmi les nombreux domaines d’application des amphipols, l’un des plus intéressants con-cerne l'étude structurale des protéines membranaires par spectroscopie RMN des solu-tions. Pour développer cette application, nous avons choisi comme modèle une protéine de struc-ture connue, le domaine transmembranaire de OmpA, une protéine de la membrane exter-ne d’Escherichia coli. Ce domaine (tOmpA) forme un tonneau _ composé de huit brins antiparallèles.
Nous présenterons tout d'abord l’aspect biochimique de ce travail, i.e. la carac-té-risation des com-plexes tOmpA/détergent et tOmpA/amphipol et la mise au point des condi-tions permettant le maintien en solution de ces complexes aux concentrations élevées requises pour la RMN. Nous examinerons ensuite, par une étude de transfert d’énergie de fluorescence entre la protéine et un amphipol marqué, la stabilité de la couche de polymère associée à la pro-téine. Enfin, nous présenterons et analyserons des cartes RMN de corrélation proton-azote des complexes tOmpA/détergent et tOmpA/amphipol. La comparaison de ces cartes permet de valider l’emploi des amphipols pour l'étude des protéines membranaires par spec-troscopie RMN à haute résolution.
ABSTRACT:
Membrane proteins usually are kept soluble in aqueous solutions using detergents. However, the dissociating character of detergents, combined with the frequent need to main-tain an excess of them, generally results in the more or less rapid inactivation of the protein under study.
Over the past few years, our laboratory has undertaken the development of a novel fami-ly of surfactants called “amphipols”. These amphiphilic polymers bind to the trans-mem-bra--ne surface of proteins by noncovalent, multiple attachment points. The proteins thus com-plex-ed remain soluble in the absence of detergent. They are generally more stable than in deter--gent solutions.
Among the many application domains of amphipols, one of the most interesting is their use in the structural investigation of membrane proteins by solution NMR spectroscopy. To develop this application, we have chosen as a model a small membrane protein of known struc-ture, the transmembrane domain of OmpA, a protein from the outer membrane of Esche-richia coli. This domain (tOmpA) is folded into an eight-strand transmembrane _-barrel.