TITRE    ÉTUDES STRUCTURALES ET FONCTIONNELLES DE L'ATPase-Ca2+ DU RETICULUM    SARCOPLASMIQUE (SERCA1a). EFFETS DES CONDITIONS DE CRISTALLISATION SUR LA    CONFORMATION DE L'ATPase-Ca2+
    TITLE    STRUCTURAL AND FUNCTIONAL STUDIES OF SARCOPLASMIC RETICULUM Ca2+-ATPase    (SERCA1a). EFFECTS OF CRYSTALLIZATION CONDITIONS ON THE CONFORMATION OF THE    Ca2+-ATPase.
    AUTEUR    Martin PICARD
    UNIVERSITE    Université Pierre et Marie Curie. (Paris VI)
    DATE    09 décembre 2005
    LABORATOIRE    Laboratoire de transport membranaire et détoxication.  Service de biophysique des fonctions membranaires,    Département de Biologie Joliot Curie (CEA)  URA CNRS 2096 (CNRS&CEA)
    DIRECTION DE THESE    Philippe CHAMPEIL
    PARRAINAGE    Philippe CHAMPEIL
RESUME :
L’ATPase-Ca2+ du réticulum sarcoplasmique est une protéine membranaire dont plusieurs conformations ont déjà été résolues par cristallographie des rayons X. Ces structures ont été bien sûr très précieuses pour l’interprétation des études fonctionnelles que nous avons tout d’abord réalisées au cours de cette thèse, sur le rôle du domaine A et de la boucle L6-7 de l’ATPase. Mais nous avons également montré que les conditions de cristallisation aboutissent parfois à des structures paradoxales : par exemple, la présence de concentrations importantes de Ca2+ pendant la cristallisation en présence d’AMPPCP conduit l'ATPase à adopter une conformation probablement différente de sa conformation moyenne en solution; de même, dans les conformations de l’ATPase proches de l’état phosphorylé dit «E2P» (obtenu en absence de Ca2+), les inhibiteurs généralement utilisés pour stabiliser l’ATPase bloquent de façon artéfactuelle la réouverture des sites Ca2+ vers la lumière du réticulum. Dans une autre perspective, nous avons également tenté de comprendre les avantages et inconvénients de divers polymères amphiphiles conçus pour stabiliser en solution les protéines membranaires solubilisées.
                                                                                                 Mots clefs: protéines membranaires, surfactants, changements de conformation, fluorescence intrinsèque, enzymologie préstationnaire, cristallographie.
ABSTRACT:
Sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase is a membrane protein for which several conformations have already been determined by X-ray crystallography. These structures have been very useful to guide interpretation of our initial functional studies of the role of the A domain and of the L6-7 loop in Ca2+-ATPase. However, we have also shown that crystallization conditions may sometimes induce artefactual structures. For instance, the presence of high concentrations of Ca2+ during the crystallization process may favour for the AMPPCP-bound enzyme a structure different from the average one prevailing in solution. Similarly, inhibitors generally used to stabilize Ca2+-free ATPase forms appear to close the access of Ca2+ to its lumenally-oriented binding sites in «E2Plike» states. Finally, we have  documented and attempted to understand both advantages and drawbacks to the use of amphipatic polymers for stabilisation of detergent-solubilized  membrane proteins in solution.                                   

Key words: membrane proteins, surfactants, conformational changes, intrinsic fluorescence, pre-steady state enzymology, crystallography