Les superoxyde réductases (SOR) représentent une nouvelle classe d’enzyme, par laquelle des organismes microaérophyles ou anaérobes éliminent le superoxyde O₂^•-. Elles catalysent la réduction mono-électronique de O₂^•- pour former exclusivement H₂O₂ :  O₂^•- + 1 e^- + 2 H⁺ ® H₂O₂  

Le site actif des SOR est formé d’un centre mononucléaire à fer atypique dans lequel le Fe²⁺ est lié à 4 histidines équatoriales et 1 cystéine axiale dans une géométrie pyramidale à base carrée. Sous sa forme oxydée, la sixième position de coordination du métal est occupée par le carboxylate d’un résidu de glutamate conservé. Les SOR sont divisées en trois classes, qui se différencient principalement par la présence ou non d’un domaine N-terminal renfermant un site métallique de type rubrédoxine.

L’étude par spectroscopie Raman de résonance d’une SOR de chacune des trois classes nous a permis de mettre en évidence des variations structurales au niveau du site actif entre ces classes. On a observé un renforcement du pouvoir électrodonneur du soufre du ligand cystéine vis-à-vis du fer de la classe 1 à la classe 3. Des études sur des mutants de l’environnement de cette cystéine ont permis de vérifier que la conformation de celle-ci est directement influencée par ces proches voisins. Des espèces de types Fe³⁺-OOH ont été proposées comme intermédiaires réactionnels possibles du cycle catalytique des SOR. Durant cette étude, nous avons démontré que les SOR sont capables de former de façon transitoire une espèce de type Fe³⁺-η²-peroxo non protonée au niveau du site actif après réaction avec un excès de H₂O₂. La mutation du glutamate conservé en alanine permet la stabilisation de l’espèce Fe³⁺-η²-peroxo indiquant que le glutamate facilite la libération du H₂O₂. Ce résidu pourrait également représenter une protection vis-à-vis d’altérations oxydatives de l’enzyme.

Nous avons identifié une espèce Fe³⁺-hydroxyde formée à haut pH au niveau du site actif. Elle est responsable des changements spectroscopiques UV-visible dépendants du pH. Des expériences d’échange isotopique ¹⁸O/¹⁶O ont montré que cette espèce HO^- vient du solvant, par déprotonation d’une molécule d’eau. Cette molécule d’eau pourrait être la source d’un des deux protons impliqués dans la formation de H₂O₂ après réduction du superoxyde.

Superoxide reductase (SOR) is a newly discovered enzymatic activity by which some anaerobic or microaerophilic organisms eliminate superoxide, O₂^•-. SOR catalyzes the mono-electronic reduction of O₂^•- to form H₂O₂ exclusively:

                                           O₂^•- + 1 e^- + 2 H⁺ ® H₂O₂  

The active site of SOR consists of a non-heme Fe²⁺ center in an unusual [His₄ Cys₁] square pyramidal pentacoordination. A conserved glutamate residue becomes the sixth Fe³⁺ ligand in the active site for the SOR oxidized form. There are three classes of SOR which are distinguished by the presence or absence of a rubredoxin –like iron center in the N-terminal domain.

Our resonance Raman spectroscopic studies on representative SOR proteins from each class revealed structural variations between each class at the level of the active site. Studies of site-directed mutants around the cystein ligand verified that its conformation and it electron density donation are both sensitive to the cystein environment. An Fe³⁺-OOH species is proposed to be an intermediate in the SOR catalytic cycle. During our work we have characterized a meta-stable non-protonated Fe³⁺-h²-O₂ species in the active site after reaction with excess H₂O₂. Mutation of the conserved glutamate residue to alanine resulted in the stabilization of the Fe³⁺-h²-O₂ species. This indicated that this glutamate side chain in the wild type SOR facilitates H₂O₂ release. The residue may also protect the enzyme against oxidative damage.

We have also identified a Fe³⁺-OH species which is responsible for previously observed pH-dependent changes in the UV-visible absorption spectrum of the SOR active site. ¹⁸O/¹⁶O isotopic exchange experiments showed that the HO^- species originates from the water solvent. Thus the second proton donor required for the H₂O₂ release after superoxide reduction originates from the water surrounding the solvent-exposed active site. 

Finally, we have shown that the conserved lysine residue adjacent to the conserved glutamate reside was in interaction with Fe³⁺-OH and Fe³⁺-h²-O₂ species resulting in the weakening of the Fe-O bonds as seen by resonance Raman. Thus, this lysine residue may influence H₂O₂ release during the catalytic cycle.