TITRE    TRANSLOCATION DE LIPIDES NON MARQUES MESUREE PAR CHANGEMENTS DE FORME    DE VESICULES GEANTES. LE CAS DE LA CERAMIDE.
    TITLE    UNLABELLED LIPID TRANSLOCATION MEASURED BY SHAPE CHANGES IN GIANT VESICLES .    THE CASE OF CERAMIDE GRAS)
    AUTEUR    Iván LÓPEZ-MONTERO
    UNIVERSITE    Université Denis-Diderot Paris 7 – Universidad Autónoma de Madrid
    DATE    13 février 2006
    LABORATOIRE    Laboratoire de Physico-Chimie Moléculaires des Membranes Biologiques UMR 7099
    DIRECTION DE THESE    Philippe F. Devaux – Marisela Vélez
    PARRAINAGE    Philippe F. Devaux
RESUME :
Une asymétrie de surface de 0,1% entre les deux monocouches des vésicules géantes (GUVs) suffit pour déclencher un changement de leur forme. L’incorporation de molécules exogènes dans le feuillet externe d’une vésicule prolate produit la formation d’un bourgeonnement. La redistribution par diffusion transversale (flip-flop) des molécules dans les deux feuillets induit la récupération de la forme rolate. Le temps moyen de flip-flop spontané des molécules non marquées incorporées peut être calculé à partir des temps mesurés des deux transitions de forme. Un temps de flip-flop inférieur à une minute à 37ºC a été mesuré pour des céramide naturelles (C6-Cer, C10-Cer, C16-Cer). La méthode a été validée par des mesures spectroscopiques(Résonance Paramagnétique Electronique) de flip-flop d’analogues de céramide dans de petits liposomes unilamellaires (LUVs). Les changements de forme de vésicules permettent également la détection du flip-flop de lipides endogènes par des protéines possédant une fonction de transocation lipidique (flippases). Nous avons reconstitué la P-gP (purifiée) et l’aminophospholipide translocase (à partir de membrane de globule rouge humain) dans des GUVs. L’activation de ces protéines par l’ajout d’ATP à l’extérieur des vésicules produit des changements de forme en accord avec un transport lipidique actif.
ABSTRACT:
A 0.1% of surface asymmetry between both monolayers of giant vesicles (GUVs) suffices to trigger shape changes in vesicles. The incorporation of exogenous molecules to the external leaflet of vesicles produces a shape change from prolate to pear that is reversed when the molecules redistribute in both monolayers, by transmembrane diffusion (flip-flop). The spontaneous flip-flop half-time of unlabelled molecules can be inferred by measuring the time of both shape transitions. A half-time for unlabeled ceramide (C6-Cer, C10-Cer, C16-Cer) flip-flop below 1 min at 37°C was measured. The method was validated by spectroscopic measures (Electronic Paramagnetic Resonance) of labelled ceramide flip-flop in large unilamelar vesicles (LUVs). Shape changes in vesicles can also be used to detect the flip-flop of endogenous lipid by the action of a flippase protein. A purified P-gP and the Aminophospholipid Translocase were reconstituted into GUVs. The protein activation by the addition of external ATP produced vesicle shape changes according to an active lipid transport.