| TITRE | L’EFFET DE LA COMPOSITION DU SOLVANT, DE L’INHIBITION ET DE LA STRUCTURE SUR LA DYNAMIQUE DES CHOLINESTERASES ETUDIE PAR LA DIFFUSION NEUTRONIQUE |
| TITLE | THE EFFECT OF SOLVENT COMPOSITION, INHIBITION AND STRUCTURE ON CHOLINESTERASE MOLECULAR DYNAMICS: A NEUTRON SCATTERING STUDY |
| AUTEUR | Frank GABEL |
| UNIVERSITE | Université Joseph Fourier, Grenoble |
| DATE | 31 Octobre 2003 |
| LABORATOIRE | Institut de Biologie Structurale |
| DIRECTION DE THESE | Dr. Giuseppe ZACCAI |
| PARRAINAGE | Jeune membre SFB |
La partie expérimentale de ma thèse comprend une série d’expériences de diffusion élastique incohérente de neutrons (IENS) sur deux enzymes importantes, l’acétylcholinestérase (AChE) et la butyrylcholinestérase (BChE). Le but de ces expériences était l’étude de l’effet du solvant et de l’inhibition sur la dynamique moléculaire de ces enzymes et de faire le lien avec leur stabilité et fonction. Les résultats principaux de ces expériences étaient : a) Une restriction de la dynamique moléculaire des enzymes en fonction des ions présent dans le solvant. b) Les dynamiques moléculaires de la BChE native et inhibée était identiques en dessous, mais différentes au-dessus de la température de dénaturation de la BChE native. Dans un cadre général, mes résultats (a) reflètent l’importance concédée à l’environnement moléculaire des enzymes pour leur dynamique moléculaire. Dans le cadre plus restreint des cholinestérases, ils ont ouvert une voie à la compréhension du mécanisme moléculaire responsable de leur stabilité contre la dénaturation en fonction du solvant : Il est concevable que la diminution de la dynamique moléculaire (sur l’échelle de l’Angström et de la nanoseconde) en fonction du type de sel présent dans l’échantillon est à l’origine de l’effet protecteur contre la dénaturation qui semble suivre la série de Hofmeister. En ce qui concerne les résultats (b), j’ai tiré la conclusion que l’inhibition stabilise l’état dénaturé de la BChE en modifiant son entropie.
J’ai également réalisé une étude méthodologique sur les conditions expérimentales propices à l’étude de la dynamique macromoléculaire en condition physiologique par IENS. Dans des conditions expérimentales courantes (macromolécules en solution aqueuse), aux mouvements fonctionnels intramoléculaires se superposent des mouvements globaux de macromolécules (rotationnelles et translationnelles) ainsi que des contributions venant du solvant. En fonction du coefficient de diffusion, de la résolution en énergie et de la gamme de transfert d’impulsion de l’instrument, leurs contributions ont été calculées. La conclusion principale de cette étude est qu’il est possible de focaliser sur les mouvements internes des grandes macromolécules en solution aqueuse sous condition de travailler en condition encombrée et sous les bonnes résolutions en énergie et transfert d’impulsion.
The enzymes acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BChE) both hydrolyse acetylcholine (ACh) very rapidly. AChE terminates nerve impulses at cholinergic synapses by hydrolysing the neurotransmitter ACh. Its catalytic turnover number ranks amongst the highest known.
A series of incoherent elastic neutron scattering (IENS) experiments were carried out on BChE and AChE samples as part of my PhD thesis. They were performed in order to investigate the effect of solvent composition, inhibition, oligomeric state and glycosylation on enzyme molecular dynamics, and the results were related to protein stability and function. IENS is a powerful tool for exploring global molecular dynamics of biological samples on an Ångström/nanosecond scale. The main results of the experiments were: a) A solvent-specific restriction of protein molecular dynamics. The presence of sodium phosphate was found to induce a decrease in protein molecular motions relative to both Tris-HCl and to the total absence of salt. b) In contrast to predictions of MD simulations and experiments on protein stability, no differences were revealed on global molecular dynamics, on an Ångström/nanosecond scale, between a native and an inhibited sample below the denaturation temperature of native BChE. In contrast, above its denaturation temperature, inhibited BChE was less flexible than the native BChE. Between AChE and BChE, no differences in flexibility were observed. We interpreted the first set of findings (a) in terms of a solvent-specific influence on molecular dynamics that may be mediated via a salt-dependent interaction with the solvent water molecules. With regard to the second set (b) we conclude that the binding of an inhibitor stabilizes the native state via a decrease of entropy of the denatured state. Differences in glycosylation and oligomeric state are of local and/or minor importance for both AChE and BChE.
In addition to the experimental work, my PhD thesis included a methodological survey of the IENS technique, treating conditions favorable to measure macromolecular dynamics in solution, as well as a review of experimental results obtained on protein dynamics by use of neutron scattering in the last decade.
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