| TITRE | ANALYSE DE LA DESTABILISATION DE LA SEQUENCE TAR ET DE SA SEQUENCE COMPLEMENTAIRE PAR LA PROTEINE NCp7 DE VIH-1 |
| TITLE | MOLECULAR ANALYSIS OF THE CHAPERONE ACTIVITY OF THE HIV-1 NUCLEOCAPSID PROTEIN p7 WITH TAR SEQUENCES |
| AUTEUR | Serena BERNACCHI |
| UNIVERSITE | Université Louis Pasteur, Strasbourg |
| DATE | 5 Juillet 2002 |
| LABORATOIRE | Laboratoire de Pharmacologie et Physico-chimie des Interactions Membranaires et Cellulaires, UMR 7034 du CNRS, Faculté de Pharmacie |
| DIRECTION DE THESE | Pr Yves MELY |
| PARRAINAGE |
L’implication de NCp7 dans de nombreuses étapes du cycle de réplication rétroviral fait de cette protéine une cible idéale pour la conception d’agents anti-VIH-1. Par son activité de protéine chaperone, NCp7 permet de stimuler le premier saut de brin lors de la transcription inverse de l’ARN génomique.
Cette étape, qui requiert une hybridation entre la séquence TAR et sa séquence complémentaire cTAR, situées aux extrémités 3’ de l’ARN génomique et de l’ADN proviral, nécessite une importante déstabilisation intramoléculaire de ces séquences. A l’aide d’oligonucléotides marqués à leurs extrémités 3’ et 5’ par des chromophores, nous avons analysé par spectroscopie de fluorescence et d’absorption le rôle de NCp7 dans cette déstabilisation. Ce travail nous a également permis de mettre en évidence l’existence d’un couplage excitonique entre les deux sondes. Ce couplage est dû à l’extrême proximité des deux sondes et provoque une variation des propriétés spectrales. Il représente ainsi un outil apte à déceler tout changement structural aux extrémités de la tige de TAR.
En présence de NCp7, l’ensemble de nos résultats suggère qu’une concentration saturante de peptide active l’ouverture transitoire des paires des bases dans les parties les moins stables des oligonucléotides et déplace l’équilibre vers les formes ouvertes des tiges-boucles en augmentant les effets de fraying spécifiques aux extrémités de TAR. Cette activation est strictement dépendante des deux doigts de zinc présents dans la NCp7.
Mots-clés : VIH-1, fluorescence, TAR, NCp7, couplage excitonique, chaperon
Due to its critical involvement in several key steps of the retroviral cycle, the nucleocapsid protein, NCp7, represents an ideal target for chemotherapies aimed against HIV-1. Due to its chaperone activity, NCp7 dramatically stimulates HIV-1 minus strand transfer during genomic RNA reverse transcription.
During this step, in a reaction mediated by base-pairing of the TAR sequence with its complementary sequence cTAR, localized at the 3’ ends of RNA and DNA reactants, these highly stable stem-loops sequences have to be unfolded. In order to examine the nature and the extent of the helix detabilizing activity of NCp7 upon TAR and its derivatives by fluorescence and absorbance techniques, we have used doubly labelled sequences. Here we report that in the closed form of the stem, the two probes are held close together, inducing the formation of a ground state intramolecular heterodimer and leading to important spectral changes. This heterodimer can be used to investigate short-range modifications of the stem structure.
Taken together our data show that a saturating amount of NCp7 activate the transient opening of base-pairs in the least stable parts of the stem, and shift the equilibrium toward open species, suggesting that NCp7 enhances fraying of the stem terminus. This destabilisation effect clearly depends on zinc-fingers motifs.
Keywords : HIV-1, fluorescence, TAR, NCp7, exciton coupling, chaperon.
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