TITRE    DYNAMIQUE ET STRUCTURE DE FIBRES DE CHROMATINE INDIVIDUELLES
    TITLE    DYNAMICS AND STRUCTURE OF SINGLE CHROMATIN FIBERS
    AUTEUR    Aurélien BANCAUD
    UNIVERSITE    Université Paris 6
    DATE    04 novembre 2004
    LABORATOIRE    Physico-Chimie Curie, UMR 168 (CNRS-Institut Curie)
    DIRECTION DE THESE    Jean-Louis VIOVY
    PARRAINAGE    Jean-Francois JOANNY, Ariel PRUNELL
RESUME :
La chromatine est la structure nucléo-protéique présente à l’intérieur du noyau des cellules eucaryotes. Son unité fondamentale est le nucléosome qui est composé de 147 paires de bases d’ADN enroulées autour d’un octamère d’histones de forme cylindrique. In vivo les nucléosomes sont régulièrement répétés et forment une fibre de diamètre &Mac197;30 nm environ, appelée fibre de 30 nm. Il est aujourd’hui établi que la chromatine est une structure dynamique, susceptible d’être réorganisée et participant activement à la régulation de l’expression génétique. Jusqu’à présent cette dynamique a été surtout mise en évidence par les techniques de biochimie et les aspects mécaniques et cinétiques ont été très peu explorés. Nous avons donc voulu les aborder grâce aux approches de molécules individuelles qui permettent d’accéder en temps réel à la réponse des fibres chromatiniennes lorsqu’elles sont soumises à des contraintes contrôlées. Plus précisément, deux montages ont été mis au point :
- un dispositif couplant épifluorescence et micromanipulation d'ADN par flux hydrodynamique dédié à la caractérisation des réactions d’assemblage en chromatine. Nous avons en particulier établi une méthode très générale pour évaluer les cinétiques dans les microcanaux qui a été employée pour caractériser des systèmes biologiques issus d’extraits cellulaires ou composés de protéines purifées.
- des "pinces magnétiques" pour sonder la mécanique en torsion des fibres de chromatine. Nous avons alors mesuré une étonnante élasticité rotationnelle de la structure attribuée à des réarrangements à grande échelle sous l’effet de la rotation. De plus, en imposant une forte contrainte positive (s ~ +0,1), nous observons une hystérésis, attribuée à un changement conformationnel du nucléosome, observé ici pour la première fois.
ABSTRACT:
The structural unit of chromatin, which is the nuclear structure of eukaryotic cells, is the nucleosome. It is composed of 147 bases pairs of DNA wrapped around a cylindrical histone octamer. In vivo, nucleosomes are regularly spaced and fold into a fiber of diameter 30 nm. This structure is strongly dynamic and plays a key role in gene regulation. Its study is hence central in modern biology. So far, this dynamics has been characterized with biochemistry approaches but mechanical and kinetic aspects have been poorly addressed. Therefore, we implemented two single molecule different set-ups to access the real time response of chromatin fibers when they are submitted to mechanical constraints.
The first apparatus combined micromanipulation with a hydrodynamic flow and fluorescence microscopy and could follow chromatin assembly in real time. A general framework to evaluate quantitatively the kinetics was proposed and different assembly systems, either cell-free or purified, were characterized.
We also built a "magnetic tweezers" device, which enabled us to exert forces and topological constraints on single fibers. We highlighted that chromatin can achieve a large torsional elasticity, about 5 times that of naked DNA. Moreover, under an excess of positive supercoiling (s ~ +0.1),